Hola Steemians. Esta vez vine a presentarle uno de los métodos más básicos que se utiliza en el laboratorio para la extracción de proteínas, en este caso hablaré de la caseína de la Leche. El relato a continuación data de cuando cursé el laboratorio de Orgánica en el 4to semestre de Biología en la facultad de ciencias UCV, en el cual los conceptos aprendidos en aquel entonces me han llevado hasta el 7mo semestre, en el que estoy actualmente.

¿A qué nos referimos cuando hablamos de proteínas?

Primeramente las proteínas son macromoléculas compuestas por aminoácidos, los cuales estos se unen a través de enlaces peptídicos. Éstas cumplen funciones fundamentales en los seres vivos por ende son imprescindibles para el crecimiento de los mismos.

La formación de una proteína viene dada desde que se codifica un ARN mensajero y es descodificado por los ARN ribosomales para luego pasar por una serie de modificaciones produciéndose así una proteína apta para cumplir una función: acompañar en algunos procesos biológicos como hacer el papel de catalizador o bien, ser una enzima.

¿Cómo puede un tipo de molécula tener tantas y variadas funciones? La explicación reside en que las proteínas, como un grupo, pueden asumir estructuras moleculares casi ilimitadas. Sin embargo, cada proteína posee una estructura única y muy ordenada que la capacita para llevar a cabo una función en particular. Más importante todavía, las proteínas poseen formas y superficies que les permiten interaccionar de manera selectiva con otras moléculas. Las proteínas, en otras palabras, exhiben un alto grado de especificidad. Es posible, por ejemplo, que una enzima sea capaz de reconocer un segmento de DNA que contiene una secuencia específica de ocho nucleótidos, al tiempo que ignora todas las otras 65 535 posibles secuencias compuestas de ese número de nucleótidos. (Karp,

A continuación les presento una imagen en el que explican los niveles de plegamiento de una proteína:

Fuente

Como las proteínas están formadas por aminoácidos, es importante entender la estructura de éste para interpretación de resultados más adelante.

Un alfa aminoácido general presenta en su estructura una carbono alfa central unido a un grupo carboxilo y un grupo amino, además de un hidrogeno y una cadena R o cadena lateral.

Fuente: Imagen extraída del libro de Biología Celular Karp 2005. Pag 50.

La cadena R es lo que define a cada uno de los aminoácidos. Dependiendo de los cambios de pH que pueden ocurrir en el medio, los grupos funcionales se pueden ionizar; tal que cuando el pH se encuentra bajo o acido estos se encuentran con carga positiva o catiónica, de modo contrario cuando el pH se encuentra alto o básico los aminoácidos se encuentran con carga negativa o aniónica. Sin embargo, para pH intermedios estos aminoácidos pueden estar en su estado neutro o con carga neta 0, es decir, formando su Zwitterión.

Desde un punto de vista fisicoquímico estas moléculas pueden ser consideradas como sistemas estructurales complejos, pues según las condiciones del medio, dicha estructura puede cambiar de forma hasta llegar a la nativa o con un plegamiento más complejo, también la existencia de grupos polares puede causar que la estructura este hidratada o bien, que dependiendo del pH del medio, el número de cargas positivas se iguale al de cargas negativas, teniendo una molécula con carga neta cero, en consecuencia se dice que estamos en presencia del punto o pH isoeléctrico de la proteína. Así mismo, si la proteína posee una carga neta (positiva o negativa), permite la solvatación del agua, causando la formación de complejos insolubles y la precipitación de los mismos.

A continuación una imagen que ilustra el texto anterior:

Fuente

Resumen de la experiencia de laboratorio:

Se realizó la obtención de la caseína de la leche que se encontraba en forma de caseinato en solución, la cual se acidifico hasta lograr el punto isoeléctrico y así obtener la caseína sólida. Hidrolizando una parte de la muestra y cromatografiandola se lograron separar e identificar los aminoácidos de la proteína (algunos). Con otra parte de la muestra se hicieron pruebas y de allí el análisis de sus propiedades.

Aislamiento de la Caseína

Para aislar la caseína, se utilizó leche descremada debido a que la leche completa contiene lípidos, los cuales complica la extracción de la proteína por los métodos utilizados, hablamos de: la utilización de ácido acético al 10% para provocar la precipitación proteína y luego un filtrado por succión, medio por el cual se aisló la proteína.

Las proteínas de la leche son globulares y por lo tanto se solubilizan en agua formando suspensiones coloidales. Existen tres tipos de proteínas contenidas en la leche: Caseinas, lactoglobulinas y lactalbuminas; por lo que se tuvo que aislar la caseína.

La caseína es denominada como proteína insoluble de la leche, sin embargo el pH de la leche es alto (entre 6,6 y 6,8), por lo que la proteína se encuentra en su forma aniónica formando la sal de calcio en solución en una distribución micelar. Esta distribución micelar se debe a que la caseína es fosfoproteica y reacciona con el calcio para formar caseinato, siendo el fosfato de calcio insoluble en medios acuosos, y además posee subunidades similares entre sí (la k, alfa y beta caseína) cuyas dos últimas de mayor tamaño y con más grupos fosfatos, las cuales se encuentran en el centro de la micela, la primera es de menor tamaño con menos grupos fosfatos y por lo tanto se encuentra en el exterior de la micela en contacto con el agua, lo que permite que dicha proteína se solubilice en el medio. Por lo que para obtener la caseína sólida, se acidifica (gota a gota con un ácido débil) el medio en donde se encuentra la proteína hasta llegar a su punto isoeléctrico, ya que se sabe que a este punto la molécula es menos soluble, es decir, menos polar, debido a la compensación interna de cargas, lo cual la caseína a pH 4,6 precipita.

A continuacion la reaccion general que ilustra la explicación anterior:

Reacción química de la acidificación de la caseína:

Hidrólisis de la caseína

Como lo explicado al principio del post, se tiene que las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos, estos se encuentran unidos entre sí por enlaces pepiticos establecido entre un grupo carboxilo de un aminoácido y un grupo amino del siguiente dando lugar al desprendimiento de agua y formación de una amida. Siendo la caseína una proteína, se sometió a una hidrólisis acida y así obtener los aminoácidos que la constituyen.

Como cada una de las proteínas tienen una organización que viene definida por cuatro niveles estructurales: primaria, segundaria, terciaria y cuaternaria (esta última no en todas las proteínas), dicha hidrólisis se realizó en medio fuertemente acido para asegurar la desnaturalización y el rompimiento de la estructura primaria de la proteína. Además de ello se utilizó la técnica del reflujo debido a que es un proceso continuo de evaporación y condensación de disolvente, esto consiste en que el agua debe entrar por una toma inferior y salir por otra superior con un flujo moderado y continuo, forma en la que se evita la pérdida de disolvente por evaporación. Además de proporcionarle calor a la solución de ácido más caseína y así obtener un aceleramiento en la reacción.

Formación de un enlace péptico entre dos aminoácidos y su reacción inversa, hidrólisis de la proteína.
Fuente: Imagen extraída del libro de Biología Celular Karp 2005. Pag 50.

Una manera de verificar si la hidrólisis de proteínas llego a completarse es a través de la prueba Biuret, pues esta es una técnica utilizada para presencia de proteínas, si da positiva (obteniendo una solución de color violeta), se debe a que las proteínas (compuesto Biuret) poseen grupos aminos con pares de electrones libres por lo que forman un complejo con iones cúpricos, confiriéndole a la solución un cambio de color de azul característico del cobre a violeta. Como en esta ocasión no queríamos la proteína sino aminoácidos, la prueba dio negativa, entendiendo así que la hidrólisis ha sido completa y que la proteína se ha separado en sus respectivos aminoácidos.

Reacción química entre la proteína desnaturalizada y el sulfato cúprico en medio básico:

Cromatografía sobre papel de los aminoácidos de la caseína.

Siendo la cromatografía un método fisicoquímico de separación de los componentes de una mezcla por lo que su fundamento se basa en el principio de distribución de fases, se llegó a utilizar la cromatografía en papel, debido a que los compuestos a separar son muy polares y con una cromatografía en capa fina no íbamos a obtener una separación optima, por ser afines a la fase estacionaria (silica). La cromatografía de papel como su nombre lo indica, la separación se realiza sobre tiras u hojas de papel filtro. Es una cromatografía Liquido-Liquido, porque la fase estacionaria es el agua contenida en la celulosa del papel. Cuando la fase móvil (solvente orgánico) pasa sobre la fase estacionaria, el compuesto problema se reparte entre ambas fases.

Cromatograma de papel, en que se realizó la separación de los aminoácidos de la muestra de caseína.
Fuente: Tomada desde un teléfono HTC Desire C.

El orden en el cual se fueron plantados los aminoácidos patrones en el papel cromatografico y el color observado en la revelación fue el siguiente: Acido glutámico: incoloro, glicina: morado claro, leucina: rosa, serina: morado oscuro, ácido aspartico: morado pálido, valina: morado oscuro, prolina: amarillo y arginina: morado intenso, donde el numero 5 era la muestra hidrolizada.

Como el RF es característico para cada compuesto bajo las mismas condiciones y se define como la distancia recorrida por un compuesto desde su origen hasta el borde de la mancha, dividida entre la distancia recorrida por el eluyente, se determinaron de tal manera que solo para la muestra hidrolizada se calcularon 5 RF según las manchas que se pudieron visualizar en el cromatograma, esto se debe a que algunos aminoácidos tienen grupos funcionales similares en las cadenas laterales por lo que tienen la misma afinidad por el solvente. Al compararlos con los RF de los aminoácidos patrones pudimos determinar a qué aminoácido pertenecen los distintos RF de la muestra.

Del mismo modo se utilizó la prueba de Ninhidrina (revelador), para detectar aminoácidos alfa (constituyentes de proteínas):

Tabla 1. Rf de los distintos aminoácidos patrones y los obtenidos de la hidrólisis de caseína:

A continuación, se presenta una tabla con las estructuras de la familia de los 20 aminoácidos más importantes, incluyendo los trabajados en la práctica: Acido glutámico, glicina, leucina, serina, ácido aspártico, valina, prolina y arginina.

Los aminoácidos se clasifican en cuatro grupos con base en la naturaleza de sus cadenas laterales, como se describe en el texto. Todas las moléculas están representadas como aminoácidos libres en su estado ionizado como existirían en solución a pH neutro.
Fuente: Imagen extraída del libro de Biología Celular Karp 2005. Pag 52.

Pruebas con la caseína aislada.

1- Prueba anfótera:

En esta prueba se observó cambio de color al basificar y acidificar el medio, además de cambios en la estructura de la porción solida de la estructura, esto se debe a que las proteínas van desde un grupo amino terminal a un grupo carboxilo final, por lo que pueden actuar como acido o como base y por ello pueden disolverse en soluciones en medio acido como en básico.

Representaciones de una proteína en medio ácido y básico.

2- Prueba con metales pesados:
Las proteínas son sensibles a sales metálicas, lo que hace que precipite de la misma manera también se observa un cambio de color en la solución. Además se basificó el medio asegurando que la proteína esté dispuesta con iones carboxilatos.

Reacción química de una proteína y un metal pesado:

Las conclusiones más resaltantes que se extrajeron para esta experiencia de laboratorio, fueron las siguientes:

• La caseína precipita cuando se acidifica la leche a pH 4,6, el cual corresponde a su puto isoeléctrico.
• La cromatografía de papel es esencial para la separación de compuestos muy polares como los aminoácidos, sin embargo es más trabajoso a la hora de emplear y leer el cromatograma.
• Las proteínas son sensibles a sales metálicas, por lo que al reaccionar con ellas, precipitan.
• Las proteínas al estar constituidas de aminoácidos capaz de aceptar y donar protones, se le confiere la propiedad anfótera, es decir, pueden actuar como base y acido según el medio en que se encuentren y por se encuentran disueltos a muy altos o muy bajos cambios de pH.

Referencias:

• Morales, Rodulfo, Escobar, Masegawa. Laboratorio de Química Orgánica. Facultad de ciencias UCV.
• Karp Gerald. Biología celular y Molecular. Conceptos y Experimentos. Cuarta Edición. Editorial macgraw_Hill. México 2009.

Vía web. Primera consulta 8/2015. Ultima consulta 03/2018

• https://mazzally.wordpress.com/tag/cromatografia/
• http://es.slideshare.net/tekkeno22/extraccion-de-caseina-de-la-leche-p3
• http://www.calvo.qb.fcen.uba.ar/proteinas.htm
• http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/estructura/EPamm3.html

Bueno amigo, la realidad es que esto es todo por este post.
Si te interesó el tema puedes escribir aca abajito y hacer preguntas o sugerencias.

¡¡Gracias por leerme. Saludos.!!